PCR ردعمل ۾ مداخلت جا عنصر

پي سي آر جي رد عمل جي دوران، ڪجهه مداخلت ڪندڙ عنصر اڪثر ڪري رهيا آهن.
PCR جي تمام گهڻي حساسيت جي ڪري، آلودگي PCR جي نتيجن کي متاثر ڪندڙ سڀ کان اهم عنصرن مان هڪ سمجهي ويندي آهي ۽ غلط مثبت نتيجا پيدا ڪري سگهي ٿي.
ساڳيا نازڪ مختلف ذريعا آهن جيڪي غلط-منفي نتيجا ڏين ٿا. جيڪڏهن پي سي آر مرکب جا هڪ يا وڌيڪ ضروري حصا يا امپليفڪيشن ردعمل پاڻ کي روڪيو وڃي ٿو يا مداخلت ڪري ٿو، تشخيصي امتحان ۾ رڪاوٽ ٿي سگهي ٿي. اهو ٿي سگهي ٿو گھٽ ڪارڪردگي ۽ اڃا به غلط منفي نتيجا.
نمائش جي اضافي ۾، نموني جي تياري کان اڳ شپنگ ۽ / يا اسٽوريج جي حالتن جي ڪري ٽارگيٽ نيوڪليڪ ايسڊ سالميت جو نقصان ٿي سگھي ٿو. خاص طور تي، اعلي درجه حرارت يا غير مناسب اسٽوريج سيلز ۽ نيوڪليڪ اسيد کي نقصان پهچائي سگھي ٿو. سيل ۽ ٽشو فيڪسيشن ۽ پيرافين ايمبيڊنگ ڊي اين اي جي ٽڪراءَ جا سڃاتل سبب آهن ۽ هڪ مستقل مسئلو (ڏسو شڪل 1 ۽ 2). انهن حالتن ۾، جيتوڻيڪ بهترين اڪيلائي ۽ صاف ڪرڻ ۾ مدد نه ڪندي.

شڪل 1 | ڊي اين اي سالميت تي متحرڪ جو اثر
Agarose gel electrophoresis ڏيکاريو ويو آهي ته ڊي اين اي جو معيار خودڪشي جي پيرافين حصن کان الڳ الڳ مختلف آهي. ڊي اين اي مختلف اوسط ٽڪرن جي ڊيگهه ۾ موجود هئي نچڻ واري طريقي جي بنياد تي. ڊي اين اي صرف تڏهن محفوظ ڪيو ويو جڏهن مقامي منجمد نمونن ۽ بفر ٿيل غير جانبدار فارملين ۾ مقرر ڪيو ويو. سخت تيزابي بوئن فيڪسيوٽ يا غير بفر ٿيل، فارميڪ ايسڊ تي مشتمل فارملين جي استعمال جي نتيجي ۾ ڊي اين اي جو وڏو نقصان ٿيو. باقي حصو انتهائي ورهايل آهي.
کاٻي پاسي، ٽڪرن جي ڊيگهه ڪلو بيس جوڑوں ۾ بيان ڪئي وئي آهي (kbp)

شڪل 2 | نيوڪليڪ ايسڊ مقصدن جي سالميت جو نقصان
(a) 3′-5′ خال ٻنهي اسٽريڊن تي لڳندو، جنهن جي نتيجي ۾ ٽارگيٽ ڊي اين اي ۾ وقفي ايندي. DNA جي ٺهڻ اڃا به ننڍي ٽڪري تي ٿيندي. بهرحال، جيڪڏهن هڪ پرائمر اينيلنگ سائيٽ ڊي اين اي جي ٽڪڙي تي غائب آهي، صرف لڪير تي واڌارو ٿئي ٿي. سڀ کان وڌيڪ سازگار صورت ۾، ٽڪرا هڪ ٻئي کي بحال ڪري سگھن ٿا، پر پيداوار ننڍا ۽ هيٺيون سطحون هونديون.
(b) بيسز جو نقصان، خاص ڪري depurination ۽ thymidine dimer ٺهڻ سبب، H-bonds جي تعداد ۾ گھٽتائي ۽ Tm ۾ گھٽتائي جي ڪري ٿي. ڊگھي وارمنگ واري مرحلي دوران، پرائمر ميٽرڪس ڊي اين اي مان ڳري ويندا ۽ گهٽ سخت حالتن ۾ به انيل نه ٿيندا.
(c) ڀرسان ٿائيمين جا بنياد TT ڊيمر ٺاهيندا آهن.
هڪ ٻيو عام مسئلو جيڪو اڪثر ماليڪيولر تشخيص ۾ ٿئي ٿو اهو آهي فينول-ڪلوروفارم ڪڍڻ جي مقابلي ۾ ٽارگيٽ نيوڪليڪ اسيد جو گهٽ وڌ کان وڌ ڇڏڻ. انتهائي ڪيسن ۾، اهو غلط منفيات سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو. سيل ڊبرس جي ابلڻ واري ليسس يا اينزيميٽڪ هضم ذريعي گهڻو وقت بچائي سگهجي ٿو، پر اهو طريقو اڪثر ڪري پي سي آر جي حساسيت جي نتيجي ۾ گهٽجي وڃي ٿو ڇاڪاڻ ته نيوڪليڪ ايسڊ جي ناکافي ڇڏڻ سبب.

amplification دوران polymerase سرگرمي جي inhibition

عام طور تي، منع هڪ ڪنٽينر تصور جي طور تي استعمال ڪيو ويندو آهي سڀني فڪٽرن کي بيان ڪرڻ لاء جيڪي ذيلي اپٽيمل پي سي آر جي نتيجن کي ڏسندا آهن. سختي سان بايو ڪيميڪل معنى ۾، رڪاوٽ اينزيم جي سرگرمي تائين محدود آهي، يعني، اهو ڊي اين اي پوليميرس جي فعال سائيٽ يا ان جي ڪوفيڪٽر (مثال طور، Taq DNA پوليميرس لاء Mg2+) سان رابطي ذريعي ذيلي پيداوار جي تبديلي کي گھٽائي يا روڪي ٿو.
نمونن ۾ موجود اجزاء يا مختلف بفرز ۽ ريجينٽس تي مشتمل اقتباس سڌو سنئون اينزيم کي روڪي سگھن ٿا يا ان جي ڪوفيڪٽرز (مثال طور EDTA) کي ڇڪي سگھن ٿا، ان ڪري پوليمريز کي غير فعال ڪري ٿو ۽ نتيجي ۾ گھٽتائي يا غلط منفي PCR جا نتيجا پيدا ڪري ٿو.
جڏهن ته، رد عمل جي اجزاء ۽ ٽارگيٽ تي مشتمل نيوڪليڪ ايسڊز جي وچ ۾ ڪيترن ئي ڳالهين کي پڻ نامزد ڪيو ويو آهي 'PCR inhibitors'. هڪ دفعو سيل جي سالميت کي اڪيلائي ۾ خلل پوي ٿو ۽ نيوڪليڪ ايسڊ آزاد ٿي وڃي ٿو، نموني ۽ ان جي ڀرپاسي جي حل ۽ مضبوط مرحلو جي وچ ۾ رابطي ۾ اچي سگهي ٿي. مثال طور، 'اسڪينجرز' هڪل يا ٻٽي-اسٽينڊڊ ڊي اين اي کي غير covalent رابطي جي ذريعي پابند ڪري سگهن ٿا ۽ انهن مقصدن جي تعداد کي گهٽائڻ سان اڪيلائي ۽ صفائي ۾ مداخلت ڪن ٿا جيڪي آخرڪار پي سي آر جي رد عمل واري برتن تائين پهچن ٿا.
عام طور تي، PCR inhibitors اڪثر جسماني رطوبتن ۾ موجود آهن ۽ ڪلينڪل تشخيصي ٽيسٽن لاءِ استعمال ٿيندڙ ريجنٽس (پيشاب ۾ يوريا، هيموگلوبن ۽ رت ۾ هيپرين)، غذائي سپليمنٽس (نامياتي اجزاء، گلائڪوجن، چربی، Ca2+ آئنز) ۽ ماحول ۾ اجزاء (فينول) ، ڳري ڌاتو)

وڌيڪ عام PCR inhibitors بيڪٽيريا ۽ يوڪريوٽڪ سيلز ۾ ملي سگھن ٿا، غير ٽارگيٽ ڊي اين اي، ڊي اين اي-بائنڊنگ ميڪروموليڪولس آف ٽشو ميٽرس ۽ ليبارٽري سامان جهڙوڪ دستانو ۽ پلاسٽڪ. ڪڍڻ دوران يا بعد ۾ نيوڪليڪ ايسڊز جي صفائي PCR انابيٽرز کي هٽائڻ لاءِ ترجيحي طريقو آهي.
اڄ، مختلف خودڪار ڪڍڻ وارا سامان ڪيترن ئي دستي پروٽوڪول کي تبديل ڪري سگھن ٿا، پر 100٪ بحالي ۽/يا مقصدن جي صفائي ڪڏهن به حاصل نه ڪئي وئي آهي. ممڪن رڪاوٽون اڃا تائين خالص نيوڪليڪ اسيد ۾ موجود هجن يا شايد اڳ ۾ ئي اثر ورتو هجي. رڪاوٽن جي اثر کي گهٽائڻ لاءِ مختلف حڪمت عمليون موجود آهن. مناسب پوليمرس جي چونڊ کي روڪڻ واري سرگرمي تي اهم اثر پئجي سگھي ٿو. پي سي آر جي روڪٿام کي گهٽائڻ لاءِ ٻيا ثابت طريقا پوليميرس ڪنسنٽريشن کي وڌائي رهيا آهن يا اضافو لاڳو ڪرڻ جهڙوڪ BSA.
پي سي آر جي رد عمل جي نمائش کي اندروني عمل جي معيار جي ڪنٽرول (IPC) جي استعمال سان ظاهر ڪري سگهجي ٿو.
احتياطي اپاءَ وٺڻ کپي ۽ ڪڍڻ واري کٽ ۾ موجود ٻيا حل، جهڙوڪ ايٿانول، EDTA، CETAB، LiCl، GuSCN، SDS، isopropanol ۽ phenol، کي نيوڪليڪ ايسڊ کان الڳ ڪرڻ لاءِ چڱيءَ طرح ڌوئڻ جي قدم سان. انهن جي ڪنسنٽريشن تي مدار رکندي، اهي پي سي آر کي چالو يا روڪي سگهن ٿا.