پي سي آر جي رد عمل ۾ مداخلت جا عنصر

پي سي آر جي رد عمل دوران، ڪجهه مداخلت ڪندڙ عنصر اڪثر سامهون ايندا آهن.
پي سي آر جي تمام گهڻي حساسيت جي ڪري، آلودگي کي پي سي آر جي نتيجن کي متاثر ڪندڙ سڀ کان اهم عنصرن مان هڪ سمجهيو ويندو آهي ۽ غلط مثبت نتيجا پيدا ڪري سگهي ٿو.
ساڳي طرح اهم مختلف ذريعا آهن جيڪي غلط-منفي نتيجن ڏانهن وٺي ويندا آهن. جيڪڏهن پي سي آر مرکب جا هڪ يا وڌيڪ ضروري حصا يا ايمپليفڪيشن رد عمل پاڻ کي روڪيو وڃي يا ان ۾ مداخلت ڪئي وڃي، ته تشخيصي امتحان ۾ رڪاوٽ پيدا ٿي سگهي ٿي. اهو ڪارڪردگي ۾ گهٽتائي ۽ غلط منفي نتيجن جو سبب بڻجي سگهي ٿو.
روڪڻ کان علاوه، نموني جي تياري کان اڳ شپنگ ۽/يا اسٽوريج جي حالتن جي ڪري ٽارگيٽ نيوڪلڪ ايسڊ جي سالميت جو نقصان ٿي سگهي ٿو. خاص طور تي، تيز گرمي پد يا نا مناسب اسٽوريج سيلز ۽ نيوڪلڪ ايسڊ کي نقصان پهچائي سگھي ٿو. سيل ۽ ٽشو فڪسيشن ۽ پيرافين ايمبيڊنگ ڊي اين اي جي ٽڪراءَ ۽ هڪ مسلسل مسئلي جا مشهور سبب آهن (شڪلون 1 ۽ 2 ڏسو). انهن حالتن ۾، بهترين اڪيلائي ۽ صفائي به مدد نه ڪندي.

شڪل 1 | ڊي اين اي جي سالميت تي متحرڪ ٿيڻ جو اثر
اگروز جيل اليڪٽروفورسس ڏيکاريو ته آٽوپسي جي پيرافين حصن کان الڳ ٿيل ڊي اين اي جي معيار ۾ ڪافي فرق هو. مختلف سراسري ٽڪرن جي ڊيگهه جو ڊي اين اي فڪسيشن جي طريقي جي لحاظ کان عرق ۾ موجود هو. ڊي اين اي صرف تڏهن محفوظ ڪيو ويو جڏهن اصلي منجمد نمونن ۽ بفر ٿيل غير جانبدار فارملين ۾ مقرر ڪيو ويو. هڪ مضبوط تيزابي بوئن فڪسيٽيوٽ يا غير بفر ٿيل، فارمڪ ايسڊ تي مشتمل فارملين جي استعمال جي نتيجي ۾ ڊي اين اي جو هڪ اهم نقصان ٿيو. باقي حصو تمام گهڻو ٽڪرا ٽڪرا آهي.
کاٻي پاسي، ٽڪرن جي ڊيگهه ڪلوبيس جوڙن (kbp) ۾ ظاهر ڪئي وئي آهي.

شڪل 2 | نيوڪلڪ ايسڊ ٽارگيٽ جي سالميت جو نقصان
(الف) ٻنهي تارن تي 3′-5′ جي فرق جي نتيجي ۾ ٽارگيٽ ڊي اين اي ۾ ٽٽڻ ٿيندو. ڊي اين اي جي سنٿيسس اڃا تائين ننڍي ٽڪري تي ٿيندي. تاهم، جيڪڏهن ڊي اين اي ٽڪري تي پرائمر اينيلنگ سائيٽ غائب آهي، ته صرف لڪير واري واڌ ٿيندي آهي. سڀ کان وڌيڪ سازگار صورت ۾، ٽڪرا هڪ ٻئي کي ٻيهر سير ڪري سگهن ٿا، پر پيداوار ننڍي هوندي ۽ ڳولا جي سطح کان هيٺ هوندي.
(ب) بنيادي طور تي ڊيپورينيشن ۽ ٿائيمائيڊائن ڊائمر ٺهڻ جي ڪري، بنيادن جو نقصان، ايڇ-بانڊن جي تعداد ۾ گهٽتائي ۽ ٽي ايم ۾ گهٽتائي جو سبب بڻجندو آهي. ڊگهي گرمائش واري مرحلي دوران، پرائمر ميٽرڪس ڊي اين اي کان ڳري ويندا ۽ گهٽ سخت حالتن ۾ به اينيل نه ٿيندا.
(c) ڀرسان ٿائمين بيس هڪ ٽي ٽي ڊائمر ٺاهيندا آهن.
هڪ ٻيو عام مسئلو جيڪو اڪثر ماليڪيولر تشخيص ۾ ٿئي ٿو اهو آهي فينول-ڪلوروفارم ڪڍڻ جي مقابلي ۾ ٽارگيٽ نيوڪلڪ ايسڊز جو گهٽ کان گهٽ بهترين ڇڏڻ. انتهائي حالتن ۾، اهو غلط منفي سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو. گهڻو وقت ابلندڙ ليسس يا سيل ملبي جي اينزيميٽڪ هضم ذريعي بچائي سگهجي ٿو، پر هي طريقو اڪثر ڪري ناکافي نيوڪلڪ ايسڊ ڇڏڻ جي ڪري گهٽ پي سي آر حساسيت جو نتيجو آهي.

امپليفڪيشن دوران پوليميرس سرگرمي جي روڪٿام

عام طور تي، روڪٿام کي هڪ ڪنٽينر تصور جي طور تي استعمال ڪيو ويندو آهي انهن سڀني عنصرن کي بيان ڪرڻ لاءِ جيڪي سب آپٽيمل پي سي آر نتيجن ڏانهن وٺي ويندا آهن. سختي سان بايو ڪيميڪل معنيٰ ۾، روڪٿام اينزائم جي سرگرمي تائين محدود آهي، يعني، اهو ڊي اين اي پوليميرس يا ان جي ڪوفيڪٽر جي فعال سائيٽ سان رابطي ذريعي سبسٽريٽ-پراڊڪٽ جي تبديلي کي گھٽائي ٿو يا روڪي ٿو (مثال طور، ٽاڪ ڊي اين اي پوليميرس لاءِ Mg2+).
نموني ۾ موجود جزا يا مختلف بفر ۽ نچوڙ جن ۾ ري ايجنٽس شامل آهن، اينزائم کي سڌو سنئون روڪي سگهن ٿا يا ان جي ڪوفيڪٽرز (مثال طور EDTA) کي ڦاسائي سگهن ٿا، ان ڪري پوليميرس کي غير فعال ڪري سگهن ٿا ۽ نتيجي ۾ گهٽجي ويل يا غلط منفي PCR نتيجا ڏين ٿا.
جڏهن ته، رد عمل جي اجزاء ۽ ٽارگيٽ تي مشتمل نيوڪلڪ ايسڊ جي وچ ۾ ڪيتريون ئي رابطي کي 'PCR inhibitors' طور پڻ نامزد ڪيو ويو آهي. هڪ ڀيرو سيل جي سالميت کي الڳ ڪرڻ سان خلل پوي ٿو ۽ نيوڪلڪ ايسڊ جاري ڪيو وڃي ٿو، نموني ۽ ان جي چوڌاري محلول ۽ مضبوط مرحلي جي وچ ۾ رابطي ٿي سگهي ٿي. مثال طور، 'اسڪيوينجرز' غير ڪوويلنٽ رابطي ذريعي سنگل يا ڊبل اسٽرينڊڊ ڊي اين اي کي پابند ڪري سگهن ٿا ۽ آخرڪار PCR رد عمل جي برتن تائين پهچڻ وارن هدفن جي تعداد کي گهٽائڻ سان الڳ ڪرڻ ۽ صاف ڪرڻ ۾ مداخلت ڪري سگهن ٿا.
عام طور تي، پي سي آر انابيٽرز اڪثر جسماني رطوبتن ۽ ڪلينڪل تشخيصي ٽيسٽن لاءِ استعمال ٿيندڙ ريجنٽس (پيشاب ۾ يوريا، رت ۾ هيموگلوبن ۽ هيپرين)، غذائي سپليمنٽس (نامياتي جزا، گلائڪوجن، چربی، Ca2+ آئنز) ۽ ماحول ۾ جزا (فينول، ڳري ڌاتو) ۾ موجود هوندا آهن.

وڌيڪ عام پي سي آر انابيٽرز بيڪٽيريا ۽ يوڪريوٽڪ سيلز، غير ٽارگيٽ ڊي اين اي، ٽشو ميٽرڪس جي ڊي اين اي-بائنڊنگ ميڪرو ماليڪيولز ۽ ليبارٽري سامان جهڙوڪ دستانا ۽ پلاسٽڪ ۾ ملي سگهن ٿا. ڪڍڻ دوران يا بعد ۾ نيوڪلڪ ايسڊ جي صفائي پي سي آر انابيٽرز کي هٽائڻ لاءِ ترجيحي طريقو آهي.
اڄ، مختلف خودڪار ڪڍڻ وارا سامان ڪيترن ئي دستي پروٽوڪول کي تبديل ڪري سگهن ٿا، پر 100٪ بحالي ۽/يا هدفن جي صفائي ڪڏهن به حاصل نه ڪئي وئي آهي. ممڪن روڪيندڙ اڃا تائين صاف ٿيل نيوڪليڪ ايسڊ ۾ موجود هوندا يا شايد اڳ ۾ ئي اثر انداز ٿي چڪا هوندا. روڪيندڙن جي اثر کي گهٽائڻ لاءِ مختلف حڪمت عمليون موجود آهن. مناسب پوليمريز جو انتخاب روڪيندڙ سرگرمي تي اهم اثر وجهي سگهي ٿو. پي سي آر جي روڪٿام کي گهٽائڻ لاءِ ٻيا ثابت ٿيل طريقا پوليمريز ڪنسنٽريشن وڌائڻ يا بي ايس اي جهڙا اضافي شيون لاڳو ڪرڻ آهن.
پي سي آر رد عمل جي روڪٿام کي اندروني عمل جي معيار جي ڪنٽرول (IPC) جي استعمال سان ظاهر ڪري سگهجي ٿو.
احتياط سان نيوڪلڪ ايسڊ آئسوليٽ مان ڪڍڻ واري ڪٽ ۾ موجود سڀني ري ايجنٽس ۽ ٻين محلولن، جهڙوڪ ايٿانول، اي ڊي ٽي اي، سي اي ٽي اي بي، ايل آءِ سي ايل، گِو ايس سي اين، ايس ڊي ايس، آئسوپروپانول ۽ فينول کي مڪمل ڌوئڻ واري مرحلي ذريعي هٽائڻ گهرجي. انهن جي ڪنسنٽريشن تي منحصر ڪري، اهي پي سي آر کي چالو يا روڪي سگهن ٿا.